1、PCR原理:在解旋酶作用下,打开DNA双链,每条DNA单链作为母链,以4中游离脱氧核苷酸为原料,合成子链,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是:变性→复性→延伸
过程 | 说明 | 图解 |
变性 | 当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链 | |
复性 | 温度下降到50℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 | |
延伸 | 72℃左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5'端向3'端延伸 |
3、结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
细胞被DNA复制与PCR技术的比较:
细胞内DNA复制 | 体外DNA扩增(PCR) | ||
不同点 | 解旋 | 在解旋酶作用下边解旋边复制 | 80~100℃高温解旋,双链完全分开 |
酶 | DNA解旋酶、DNA聚合酶 | TaqDNA聚合酶 | |
引物 | RNA | DNA、RNA | |
温度 | 体内温和条件 | 高温 | |
相同点 | ①需提供DNA模板 ②四种脱氧核苷酸为原料 ③子链延伸的方向都是从5'端到3'端 |
知识点拨:
1、DNA分子复制的人工控制
解开螺旋:在80~100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:在50~60℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。
2、PCR的含义是多聚酶链式反应。
3、PCR技术反应的条件:①稳定的缓冲溶液环境;②DNA模板;③合成引物;④四种脱氧核甘酸;⑤DNA聚合酶;⑥温控设备
4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。
5、TaqDNA聚合酶的特点是:耐高温。
知识拓展:
1、DNA含量的测定??分光光度法
项目 | 说明 | |
原理 | DNA在260nm的紫外线波段有一强烈吸收峰,峰值大小与DNA的含量是正相关 | |
过程 | 稀释 | 2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释 |
对照调零 | 以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的赌注调节至零 | |
测量 | 取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值 | |
计算 | DNA含量(μg/mL)=50×(260nm的读数)×稀释倍数 |
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