（一）免疫球蛋白的提取
（二）荧光素
1．荧光色素的基本条件
（1）具有化学活性基团，如异硫氰基（-NCS）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。
（2）对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。
（3）荧光效应高，与蛋白结合需要量少。
（4）荧光素性能稳定，结合物性能稳定，容易贮藏。
（5）结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。
到目前为止，基本符合上述要求的荧光素只有异硫氰酸荧光素（FITC），丽丝胺罗丹明B200（RB200）。
2．常用的荧光色素
（1）异硫氰酸荧光素：又称异硫氰酸荧光黄，纯品为橙黄色粉末。分有结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度大、稳定、优于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸盐缓冲液中。最大吸收波长为495nm。最大发射波长520nm。异硫氰酸荧光黄性质稳定，于低温下可保存二年以上，但久置标记抗体能力弱，荧光亮度差，故应采用新产品。
异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。一个IgG分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。
（2）丽丝胺罗丹明：为褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。荧光为桔红色。性质稳定，可长期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量为580，最大吸收波长570nm，最大发射波长为600nm。
由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与FITC标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（PCl5）处理，使染料的-SO3Na基变为-SO3Cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。
（三）标记方法
异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：
1．搅拌法
（1）取一定量的纯IgG液，用0.5Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。
（2）按荧光素与蛋白质比1?20～1?100（一般用1?100）称取异硫氰酸荧光素，用pH9.5碳酸盐缓冲液溶解。
（3）将球蛋白液置于电磁搅拌器上，启动开关，轻轻搅拌，以不起沫为准。逐滴加入荧光素液（约10min～15min加完）。加完后，随时用试纸测定搅拌液的pH值，若低于9.0，则应以碳酸钠溶液调整。置4℃搅拌6h～12h即可。
2．透析法
（1）将IgG液以0.5Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释成1%浓度，装入透析袋中。
（2）将荧光素配成0.1mg/ml，其量为1%蛋白液的10倍，装入烧杯中。
（3）将透析袋置于烧杯中，放电磁搅拌器上4℃搅拌24即可。
透析法的优点是标记均匀，非特异性荧光少，但所标记的时间长，荧光素的用量多，约比搅拌法多10倍。
3．影响标记的因素
（1）荧光素与蛋白质的比值：这也取决于荧光素的质量与保存期。一般而言，粉末状荧光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白质为宜，而结晶型则只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白质即可。
蛋白含量以20mg～25mg/ml为宜，浓度过低标记过慢。浓度过高，标记效果不好。不过在实践中，以稍高一些蛋白浓度为好。
（2）pH值：以pH9.0～9.5为最好。过低标记速度慢，过高蛋白质容易变性。
（3）温度和时间：温度4℃～25℃均可。温度与时间是成正比的，温度低，反应慢，温度高，反应快。4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。实践中可自选。透析法还是以4℃较长时间反应为好。
（4）荧光素的质量及有效期。
（四）标记抗体的纯化
标记后溶液是一个混合体，它包括蛋白质与荧光素的结合体，还有游离的荧光素、游离的蛋白质以及结合过多的蛋白质。对于某些细菌性的诊断荧光抗体，则只要去除游离的荧光素即可。对于一般组织染色荧光抗体，则要去除过度标记的抗体即可。只是对某些特殊要求的组织染色试剂，则必须经过仔细的处理，包括具有特异性交叉反应或非特异性反应性的除去。
1．去除游离的荧光素
（1）透析法：将标记好的抗体放入透析袋中于0.01Mol/LpH7.6PBS中或生理盐水中4℃透析数天，每天换液数次，直至透析液中无游离色素为止。通常约需5～7天才能透析完毕。
（2）凝胶过滤：以G25或G50葡聚糖凝胶装柱进行过滤。次法速度快，一般1h～2h即可完成。也可以先透析4h～5h，让大部分游离荧光素除去，再过G25或G50柱。
2．去除过度标记的蛋白质分子可采用DEAE?纤维素过柱法。利用阶梯洗脱法进行，具体方法如下：
（1）以0.01Mol/LpH7.6PB液洗脱。
（2）以0.01Mol/LpH7.6PBS液（0.05Mol/LNaCl）洗脱。
（3）以0.01Mol/LpH7.6PBS（0.1Mol/LNaCl）洗脱。
（4）以0.01Mol/LPH7.6PBS（0.2Mol/LNaCl）洗脱。
收集每部分有荧光抗体的洗脱液管，于495nm测荧光素的OD值，再于280nm测蛋白的OD值，查标准曲线，算出各管荧光素和蛋白质的浓度，并计算出F/P比值（见后介绍），将合格者合并，浓缩后分装小瓶备用。
层析柱上滞留的过度标记的蛋白质，可用1Mol/L的NaCl洗脱。
3．去除交叉反应等非特异性染色因素非特异性染色的干扰因素，包括免疫血清的不纯、类属抗原以及荧光色素的质量不高、标本处理不当等。可以以脏粉进行吸收。具体做法如下：于每ml标记抗体中加入脏器干粉（脏粉制法见附录）100mg，充分混合，于室温中振荡约1h，然后以10000r/min离心30min，吸取标记抗体。必要时可减半脏粉用量再处理一次。
经过脏粉吸收后的荧光抗体必须加0.1%叠氮钠防腐（注意不能加硫柳汞，因为重金属对荧光素有影响）。分装小瓶冷冻保存。
（五）标记抗体的鉴定
1．F/P比值鉴定荧光色素与球蛋白的结合率即为F/P比值。分别制备荧光色素与蛋白质的标准曲线。
异硫氰酸荧光素的标准曲线是以0.5Mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液分别配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0μg/ml的浓度，在495nm波长测其OD值，按重量与OD值在坐标上制成标准曲线。
蛋白的标准曲线是将牛血清蛋白分别配成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml…1.6mg/ml，在280nm测其OD值，并绘制成曲线。按以下公式计算F/P比值：
1．6×104FITCμg/mlFITCμg/ml
F/P（克分子比值）=×=0.41×
390抗体mg/ml抗体mg/ml
式中1?6×104为抗体蛋白质的分子量，390为异硫氰酸荧光素分子量。
F/P克分子比值以1～2为合适，1～3.5为合格。比值过低敏感性差，比值过高，易出现非特异性反应。用于检查组织细胞抗原成分，F/P以1～2为好；用于检查细菌涂片时，F/P以2～3为好。
2．免疫电泳测定通过免疫电泳可以测定荧光抗体的免疫纯度。要求在球蛋白的部位上只出现一条沉淀线。
3．染色性能的鉴定包括测定荧光抗体的敏感性与特异性。
（1）荧光抗体效价的测定：将荧光抗体倍比稀释，然后用已知抗原制片，分别用各稀释度去染色，观察“++”荧光强度的最大稀释倍数即为该荧光抗体的染色滴度（或单位）。实际应用时则取2个或3个单位做应用的稀释度。
（2）荧光抗体的特异性试验：为了确保荧光抗体的特异性，必须预先进行下列试验。①阳性标本染色试验：即用所制荧光抗体去染色已知的相应的抗原，结果应是阳性；②阴性标本染色试验：即用所制荧光抗体去染色已知的非相应抗原，结果应是阴性；③类属性抗原染色试验：取与已知抗原相近的类属抗原（如炭疽杆菌与枯草杆菌或类炭疽杆菌等），用荧光抗体染色，应为阴性，说明特异性强，如不同程度地出现有荧光，说明具有类属反应，特异性不强等；④抗体吸收试验：以过量的相应抗原加入荧光抗体中，感作2h~4h，4℃过夜，离心取上清再对相应抗原染色，应无荧光或荧光显著消退；⑤染色阻抑试验：用未标记的抗体对相应抗原进行染色，冲洗后，再用荧光抗体对相应抗原进行染色，结果观察，应无荧光。阻抑试验应注意抗体与抗原的相应比例，未标记抗体的比例过小，结果抗原结合有剩余，标记抗体仍能被结合而显示出阻抑不全。当抗体比例过大，则抗体的一个结合点结合而表现出不牢固，极易被标记抗体所置换出来而又显示出阻抑不全。
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